布里斯托病毒所公布乙脑病毒侵袭机制,对乙型脑炎病毒说不

流行性乙型脑炎属于乙类传染病,1950年以来,中国对该病进行了大量病原学和流行病学研究,为了与甲型昏睡性脑炎相区别,定名为流行性乙型脑炎,简称乙脑,是中国夏秋季流行的主要传染病之一,年发病人数2.5万,病死率10%,大约15%的患者留有不同程度的后遗症。

论文第一作者、助理研究员刘海滨等系统地分析了乙脑病毒囊膜蛋白的结构,认为16个关键氨基酸位点或区段对病毒入侵可能至关重要,利用定点突变技术将16个突变引入E基因,并通过反向遗传操作系统构建一系列E蛋白单点突变或区段缺失的重组病毒。他们意外地发现,10个突变不能有效地产生子代病毒颗粒,其中5个突变R9A和I0、ij、BC、FG破坏了病毒颗粒的包装,另外5个突变E373A、F407A、L221S、W217A和kl阻滞了病毒颗粒的释放。随后,他们以野生型病毒为对照,重点检测能够生产感染性颗粒的6种突变病毒株的进入活性。实验发现以往被普遍认为是受体结合域的糖基化位点N154和DEloop并不是乙脑病毒进入哺乳动物细胞BHK-21的关键位点,其突变对病毒入侵没有显着性影响。H144和H319两个正电氨基酸参与囊膜蛋白“盐桥”的形成,T410和Q258则参与病毒-细胞膜融合“拉链”的形成,这4个位点中任一位点的单点突变都会抑制病毒-细胞膜融合。最后,连续传代几个突变病毒株并进行测序分析发现:大部分适应性突变发生在囊膜蛋白表面,主要是由负电氨基酸突变为正电或不带电荷的氨基酸,某些适应性突变能够很好地恢复前述定点突变病毒株的入侵活性。

1.2 JEV的结构蛋白和非结构蛋白特性

“其中5个突变——R9A和I0、ij、 BC、FG 破坏了病毒颗粒的包装,另外5个突变——
E373A、F407A、L221S、W217A和kl阻滞了病毒颗粒的释放。”肖庚富说。

该研究得到了纳米研究国家重大科学研究计划和国家自然科学基金青年项目的资助。

由于JEV病毒M基因参与病毒囊膜的构成,对维持E蛋白结构是必要的,E基因与病毒吸附穿入致病和机体的免疫应答作用密切相关,它能刺激机体产生中和抗体和血凝抑制抗体,为免疫源性蛋白。李自力等[23]用乙型脑炎病毒E
基因有4个点突变的SA14-14-2株,
成功构建了一株乙脑病毒prM/E基因重组伪狂犬病病毒TK-/gG-/prM/E+,这为开展乙脑病分子生物学及多价基因工程疫苗的研究打下了坚实基础。Mori
Y等[24]对1株野毒株与突变株M4243核心蛋白进行核定位研究,发现突变株M4243的核定位序列(nuclear
localization
signals,NLS)中有两个位点突变,使得突变株M4243在Vero细胞上生长受阻,而且病毒的嗜神经毒性也生了很大变化,表明JEV核心蛋白的NLS
对病毒在动物细胞和体外繁殖的致病机理有着重要的作用。Konishi等研究表明prM和E蛋白具有免疫源性,能诱导机体产生持久的抗体和T记忆性细胞,引起保护性免疫反应,是重组病毒接种后引起保护免疫反应的关键成分。而Mason等研究表明,在重组病毒同时表达prM、E、NS1基因时,产生的病毒样粒子的量减少,有可能是在病毒囊膜组装的某一阶段,NS1蛋白和病毒结构蛋白结合影响毒样粒子的产生和释放。但Mason
B
A等在发现释放的病毒样粒子在保护性免疫反应有重要作用的同时,也发现与细胞相连的E蛋白在prM存在的情况也是有效的免疫原
,其中prM蛋白有稳定E蛋白的作用,因此prM/E基因的获得,为进一步研究prM/E蛋白的表达、单克隆抗体的制备、基因工程疫苗和基因免疫苗等方面提供了广阔的前景;通过对基因序列分析得知,克隆起主要保护作用的prM/E基因片段,用该基因制造疫苗是可行的,将为乙脑活载体疫苗的研制打下良好基础[25]。

“我们在日本脑炎病毒发现H144、H319、T410和Q258四个位点和病毒进入有关,病毒还是活的病毒,只是进入细胞能力减弱。其他几个黄病毒目前还没有减毒活疫苗,利用这四个突变位点或许可以设计出新的疫苗。”他们的终极目标是构筑阻挡黄病毒进入的“长城”。

论文共同作者之一、黄病毒专家张波认为,此项研究揭示了乙脑病毒囊膜蛋白关键位点在病毒组装、释放和进入过程中的作用,为进一步理解其它黄病毒的入侵机制做出了贡献。从遗传进化上看,黄病毒科病毒的囊膜蛋白均高度保守,入侵活性致弱的乙脑病毒囊膜蛋白突变株H144A、H319A、T410A和Q258A可为其它黄病毒减毒活疫苗的研究与开发提供重要的借鉴。

NS5蛋白是分子质量最大且是黄病毒科中最保守的蛋白[7]。与其他病毒的RNA多聚酶比较,乙脑病毒NS5蛋白存在有RNA多聚酶的一些功能基团,这些功能基团主要位于其羧基端
2/3区域[8],提示乙脑病毒NS5蛋白就是乙脑病毒的RNA多聚酶。而余福勋等[7]通过研究提示乙脑病毒NS5蛋白与乙脑病毒的致病有一定关系,并成功表达、纯化了乙脑病毒部分及全长NS5蛋白,纯化的乙脑病毒NS5蛋白在体外证实具有RNA依赖性RNA多聚酶活性。

进一步的研究表明,H144和H319两个正电氨基酸参与囊膜蛋白“盐桥”的形成,T410
和 Q258
则参与病毒—细胞膜融合“拉链”的形成,这4个位点中任一位点的单点突变都会抑制病毒—细胞膜融合。

中国科学院武汉病毒研究所研究员肖庚富领导的科研团队在乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV)囊膜蛋白介导病毒入侵宿主细胞分子机制研究方面取得新进展,相关研究结果Structure-basedmutationalanalysisofseveralsitesintheEprotein:ImplicationsforunderstandingtheentrymechanismofJapaneseencephalitisvirus近日在病毒学期刊Journalofvirology上在线发表。

prM蛋白是未成熟病毒体的一部分,在病毒感染后期,它被水解为M蛋白后才发育为成熟的病毒体[3,6],它可以诱导保护性免疫。M蛋白参与病毒囊膜的构成。

登革热病毒、蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒都是黄病毒科里可怕的乙脑病毒兄弟,而乙脑病毒目前已经研发出相关疫苗。科研人员通过生物信息学分析发现这“三兄弟”和乙脑病毒相比在最重要的抗原-E蛋白上有多个位点一模一样,对乙脑病毒E蛋白的详尽解析结果可以方便地推导到其他黄病毒疫苗研发中去。

乙脑病毒是和黄热病毒、登革热病毒、西尼罗病毒同一属的虫媒黄病毒,可感染蚊子、鸟、猪,人为其终末宿主,并引起病毒性脑炎。乙脑病毒已经从日本等亚洲地区传播到澳大利亚约克角半岛,给世界公共卫生安全带来日趋严重的威胁。乙脑病毒表面的囊膜蛋白E介导病毒入侵宿主细胞,包括病毒与细胞受体结合、受体介导内吞、低pH诱导病毒膜与胞内体膜的融合过程。

JEV的分子生物学特性

日本学者最早从因脑炎死亡病人的脑组织中分离到乙型脑炎病毒,因此国际上又称之为日本脑炎病毒。原本该病毒只在亚洲区域猖獗。然而,2006年在澳大利亚约克角半岛的蚊子和猪身上也发现了乙型脑炎病毒。它的行走轨迹大概是从亚洲传播到巴布亚新几内亚,通过托雷斯海峡到了约克角半岛。澳大利亚是个大岛国,如果再进一步扩散到医疗条件落后的非洲后果将会不堪设想,给世界公共卫生安全带来严重的威胁。

武汉病毒所揭示乙型脑炎病毒入侵机制
图片 1

李晓宇等[18]对1949年以来在中国乙脑主要流行地区分离的19株乙脑病毒的prM-C区及E蛋白基因区的核苷酸序列进行了对比研究,以乙型脑炎病毒疫苗株P3株为标准,对各病毒E蛋白500个氨基酸序列进行分析,
结果发现其中18株病毒E蛋白活性结构域与疫苗株P3株相比共有247个氨基酸的差异,平均每株病毒有12个~35个氨基酸的差异,而且其中包含着E402重要位置的氨基酸差异。有待进一步深入研究这种差异对病毒的毒力有何影响。

肖庚富小组:对乙脑病毒说不

李玉华等[19]通过比较乙型脑病毒弱毒株at222与强毒AT31全基因核甘酸序列,结果发现E138位点的氨基酸为强毒JaGArol、JaoAr9982、Beijing-1与SA14所共有,而at222E138、E176位点上氨基酸决定了乙脑病毒的病原性。乔宪凤等[20]对WHe株和12株JEV强毒株与减毒活疫苗SA14-14-2氨基酸序列比较,结果发现有一个新的可能与JEV毒性密切相关的位点E447,该残基在E蛋白结构域Ⅲ茎-锚区的一个α螺旋中,对蜱传脑炎病毒(Tick-bore
encephalitis
virus,TBEV)的研究已证实此茎-锚区的结构完整性对prM-E蛋白异源二聚体的稳定性是必需的,而该二聚体在JEV吸附和穿入宿主细胞的过程中起重要作用。

“乙脑病毒是和黄热病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒为同一属的黄病毒,可感染蚊子、水鸟、猪,人为其终末宿主,并引起病毒性脑炎。”肖庚富告诉记者。

非结构蛋白有RNA依赖的RNA聚合酶NS3及NS5。NS3作为解旋酶、蛋白酶以及RNA酶复合物的一部分,裂解聚合蛋白的大部分。NS3蛋白的C末端和
N末端的氨基酸组成已研究清楚,具有亲水性基团。Takegami等认为,NS3蛋白是一个具有激酶和解旋酶特性的多功能蛋白。交叉免疫试验表明,NS3是最主要的交叉反应蛋白。NS3蛋白还具有与
RNA结合及 ATP活性。Chen等研究了JEV3′- NCR与 NS3蛋白和
NS5蛋白的相互作用,发现NS3和NS5在体内相互作用形成蛋白复合物,继而与 3′-
NCR的茎环结构形成复制复合体参与负链
RNA的合成。可见,NS3蛋白在病毒感染细胞中对病毒
RNA的复制具有十分重要的功能。

■本报记者 王晨绯

JEV有3种结构蛋白:核衣壳蛋白、膜蛋白、囊膜糖蛋白;7个非结构蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)。

《中国科学报》 (2015-03-30 第6版 进展)

对RNA病毒而言,一般认为帽状结构可增加RNA的感染性,这可能与其可提高翻译效率、增加RNA的稳定性和防止宿主细胞对RNA的降解有关。5′端帽状结构对多数病毒RNA的稳定性和感染性具有重要作用,而对另一些病毒的RNA则非必需[4]。黄庆生等[5]研究表明,裸露的乙脑病毒RNA是否有5′mGpppA对其感染性和稳定性没有任何影响。而天然的乙脑病毒RNA都带有帽状结构,有待于进一步探讨这一结构对该病毒的转录与翻译起何作用?

我们在日本脑炎病毒发现H144、H319、T410和Q258四个位点和病毒进入有关,病毒还是活的病毒,只是进入细胞能力减弱。其他几个黄病毒目前还没有减毒活疫苗,利用这四个突变位点或许可以设计出新的疫苗。”

对乙型脑炎病毒功能与结构的研究尤其是对影响乙脑病毒毒力的关键性位点或功能域的定位,一直是乙脑病毒的研究热点。这些研究为乙脑的新型疫苗研制提供了理论基础,但不同毒株毒力和致病机理有些差异。许多研究者对不同型JEV毒株的强毒株的基因序列进行比较,推测出减毒的关键位点或区域。乙脑病毒SA14株的致病力关键性位点是通过减毒的活疫苗株与亲代毒株的核酸序列比较推测出来的[10-13];Hasegawa
H等[14]将JEV
kamiyama株与其减毒株进行氨基酸序列比较,发现E364(Ser→Pro)、E367(Asp→Ile)和E52(Gln→Arg/Lys)的替代,可降低其对3周龄小鼠的毒力,且改变JEV与细胞间的早期作用;Cecilia
D等[15]通过对JEV
Sar两个毒力降低的变异株r27和r30氨基酸的比较发现,其中E270位点Ile变为Ser,E333位点Lys变为Asp,导致了乙型脑炎病毒毒力的改变;Vrati
S等[16]报道神经侵袭力较弱G78株毒力定位到E蛋白的序列上,E76位点Thr变为Met,影响了病毒与细胞的融合。由此可见,E蛋白有着多个影响乙型脑炎病毒毒力表型的位点,我国学者范行良[17]的相关报道对此予以了证实。

随后,他们将几个突变病毒株连续传代并进行测序分析发现:大部分适应性突变发生在囊膜蛋白表面,主要是由负电氨基酸突变为正电或不带电荷的氨基酸,某些适应性突变能够很好地恢复前述定点突变病毒株的入侵活性。

JEV基因组为单分子线状正股单链RNA,球形,有囊膜,直径约为40
nm,GC含量为47%~49%,其基因组长度约为11
kb,其中5′端有Ⅰ型帽状结构,3′端无 poly
A尾[2]。病毒基因组仅含有一个开放阅读框(open reading
frame,ORF),编码产物通过裂解和加工形成约10个蛋白,由5′端末端编码,而3′端编码非结构蛋白(nonstructural
protein,NS)。包括3个结构蛋白基因:核衣壳蛋白、膜蛋白、囊膜糖蛋白,7个非结构蛋白基因(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)和2个非翻译区。根据核苷酸和部分氨基酸序列确定的基因组顺序为5′-C-PrM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3′[3]。

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随着生物信息学的发展,人们利用生物信息学方法对乙脑病毒E蛋白的三维结构进行了预测,发现在乙脑病毒E蛋白活性区中存在着3个活性结构域。JEV毒力相关位点可能集中在3个结构域。结构域Ⅲ的远侧面,有一类似IgC的结构,可能与受体的结合有关;结构域Ⅱ的底部,可能与pH依赖的融合活性相关,在该空间结构相应的位置上氨基酸残基的变异会导致病毒毒力的变化;结构域Ⅰ/Ⅲ交界处与cd环相对区域的氨基酸突变导致毒力发生了改变[18]。Vrati及Hasegewa等的试验证实了这一预测;Arroyo
J等根据上述预测的E蛋白空间结构,提出E蛋白中有10个决定JEV毒力表型的氨基酸位点,并用定点突变的试验方法加以验证。这些位点多存在于E蛋白各个结构域交界处高度保守的发夹环模体中,各结构域表面茎区中氨基酸性质的改变,严重影响JEV毒力表型的改变。JEV的主要毒力取决于E蛋白,但决定乙脑病毒毒力的因素却不限于E基因。MandI
C
W等对蜱传脑炎病毒的研究证实,结构蛋白C上的氨基酸缺失会引起病毒毒力下降,这对乙脑病毒毒力的研究也具有一定的指导作用。有研究报道在乙脑病毒及黄病毒科的其他病毒非结构基因NS3[21]、NS4和NS5[22-23]上的变异,引起了该病毒毒力减低。这对弱毒苗减毒的分子机理的阐明具有一定意义,为解释病毒的致病性、毒力变异提供了确切的分子结构基础。

“我们想利用定点突变技术将这16个突变引入E基因。并通过反向遗传操作系统构建16个E蛋白单点突变或区段缺失的重组病毒。”这是刘海滨和同事们一开始的设想。

C蛋白由 136个氨基酸组成,相对分子质量 13 ku,位于第 1个 AUC起始的单一
ORF的 N末端。首先由氨肽酶切除大分子前体蛋白第 1个甲硫氨酸残基 形成
C蛋白,在合成部位由
C端疏水性氨基酸将其暂时固定在粗面内质网上,以便装配成衣壳,用来包装基因组。富含赖氨酸
和精氨酸
所带的正电荷在形成壳体时,可与基因组相互作用。C蛋白的作用是在合成部位由
C端疏水性氨基酸将其暂时固定在宿主细胞的粗面内质网膜上,以便装配成核衣壳包裹基因组,保护基因组免受核酸酶或其他因素的破坏。

论文第一作者、助理研究员刘海滨等系统地分析了乙脑病毒囊膜蛋白的结构后,认为16个关键氨基酸位点或区段对病毒入侵可能至关重要。

NS2蛋白:NS2A的分子质量约为17 ku,NS2B约为13
ku,均为疏水性蛋白,在所有黄病毒中其同源性最低。NS2蛋白可能与膜功能有关。

肖庚富团队在乙脑病毒研究中有着多年积累,在接受《中国科学报》记者采访时,他介绍说:乙脑病毒入侵宿主细胞是通过其表面的囊膜蛋白E介导,包括病毒与细胞受体结合、受体介导内吞、低pH诱导病毒膜与胞内体膜的融合过程。

乙型脑炎病毒的毒力特性和致病机理是目前研究较多的课题,分子生物学技术的应用对此提供了良好的手段,但致病机理是一个比较复杂的过程,而且取决于多种因素,JEV基因组是RNA分子,RNA分子复制缺乏纠错机制,因此JEV的变异率较高。地理位置、气候等因素、可能导致JEV的基因型和表型发生改变。不同地方JEV分离毒株毒力和致病机理也会有一些差异,因此,研究结果不尽相同。有许多方面仍需要进一步研究,如乙型脑炎病毒减毒株减毒的分子机理、JEV的3′和5′端非编码区中氨基酸对JEV毒力变化的影响、JEV关键性位点或区域是如何起作用的、JEV的分子遗传特性与其生物学性状和功能的关系、病毒移行规律、组织嗜性等。因此,还需要在广大科研人员的不断努力下,进一步探索乙型脑炎病毒的致病机理,为今后对本病的新型预防与治疗措施提供理论依据。

“以往被普遍认为是受体结合域的第154位N糖基化位点和DE环区,并不是乙脑病毒进入哺乳动物细胞的关键位点,其突变对病毒入侵没有显著性影响。”肖庚富说。

NS1是糖基化蛋白,为乙脑病毒的保护性抗原,而NS1蛋白为可溶性补体固定抗原。非结构蛋白NS1在感染细胞的表面表达,细胞外分泌,不仅能诱导免疫反应而且能提供保护性作用。这个保护作用依赖抗体的Fc部分,
NS1专一性抗体通过补体依赖途径杀死目标细胞[9]。这为JEV核酸疫苗的研制提供了依据。

揭示乙脑病毒入侵机制

E蛋白基因大小为1 500 bp,编码500个氨基酸残基,分子质量53
ku,囊膜糖蛋白E是主要的毒力抗原,参与病毒复制的许多过程,包括结合受体、膜融合和毒粒包装等[2-3];E蛋白上有特异性抗体的中和表位,可诱导免疫动物产生中和抗体。E蛋白与病毒的毒力、宿主范围、组织嗜性、膜融合、保护性免疫、血凝反应和血清特异性有关。以往关于JEV
E蛋白表位的研究中,公认E蛋白分为3个结构区[6],即Ⅰ区、Ⅱ区和Ⅲ区。Ⅱ区被认为具有中和与血凝抑制的表位,Ⅲ区具有受体结合活性。

“从遗传进化上看,黄病毒科病毒的囊膜蛋白均高度保守,入侵活性致弱的乙脑病毒囊膜蛋白突变株H144A、H319A、T410A和Q258A可为其他黄病毒减毒活疫苗的研究与开发提供重要的借鉴。”黄病毒专家张波研究员表示,“这项研究揭示了乙脑病毒囊膜蛋白E的关键位点在病毒组装、释放和进入过程中的作用,为进一步理解其他黄病毒的入侵机制作出了贡献。”

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随后,他们以天然存在的野生型病毒为对照,重点检测能够生产感染性颗粒的6种突变病毒株的进入活性。

3 结语

科学家揭示乙脑病毒入侵机制

日本脑炎病毒(Japanese encephalitis
virus,JEV),又称乙型脑炎病毒,简称乙脑病毒,属于黄病毒科(Flaviridae)黄病毒属。由JEV引起的脑炎是严重威胁人畜健康的一种中枢神经系统的急性传染病。由蚊作为传播媒介,以高热、狂暴或沉郁等神经症状为特征。具有明显的季节性和一定的地理分布区,多发于夏秋蚊类大量孳生的季节。JEV基因组为正链RNA,长约11
kb,包括3个结构蛋白基因,7个非结构蛋白基因和2个非翻译区。由JEV引起的流行性乙型脑炎主要在东亚的一些国家和地区流行,我国是流行性乙型脑炎的高发区,亚洲每年乙脑病例有5万多人,其中约有万人被致死,因此流行性乙型脑炎是亚洲公共卫生的重要问题之一[1]。流行性乙型脑炎属于自然疫源性疾病,猪是主要中间宿主和扩散宿主,也是主要的传染源。许多研究表明,猪流行性乙型脑炎与人流行性乙型脑炎密切相关,因此预防猪感染本病是防止人患乙脑的重要措施。同时,乙脑也是猪的重大疫病之一,能引起怀孕母猪流产、死胎及弱仔,公猪睾丸炎,仔猪呈神经症状,其暴发常给养猪业带来巨大的经济损失。

近年来,肖庚富团队关注病毒进入宿主细胞的分子机制及研发进入抑制剂。之所以选择乙脑病毒来进行研究,是因为该病毒感染包括蚊子、老鼠、猪、人等广泛的物种,感染模型比较齐全。

NS4蛋白:NS4A和 NS4B均为疏水蛋白。有关其结构与功能方面的研究未见报道。

近日,中科院武汉病毒研究所研究员肖庚富领导的科研团队在乙型脑炎病毒(Japanese
encephalitis
virus,JEV)囊膜蛋白介导病毒入侵宿主细胞分子机制研究方面取得重要进展。相关研究结果在病毒学领域重要期刊病毒学杂志Journal
of Virology 上在线发表。

1.1 JEV的基因组特性

然而在实验操作过程中,他们意外地发现,设想中表达出的16个突变里有10个不能有效地产生子代病毒颗粒。

2 JEV毒力和致病分子机理

除此之外,肖庚富团队此前还在乙型脑炎病毒抗病毒多肽方面,发现了一条可以有效抑制乙型脑炎病毒感染的12肽。而此次的新发现则是关于乙型脑炎病毒如何进入细胞的机制和过程。

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